Dankon pro vizito de Nature.com. La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon. Por plej bonaj rezultoj, ni rekomendas uzi pli novan retumilon (aŭ malŝalti kongruecreĝimon en Internet Explorer). Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
La establado de bestaj modeloj de modika ŝanĝo (MC) estas grava bazo por studi MC. Kvindek kvar Nov-Zelandaj Blankaj kunikloj estis dividitaj en ŝajn-operacian grupon, muskol-enplantadgrupon (ME-grupon) kaj kernan pulposus-enplantadgrupon (NPE-grupon). En la NPE-grupo, la intervertebra disko estis elmontrita per anterolateral lumba kirurgia aliro kaj kudrilo estis uzata por trapiki la L5-vertebran korpon proksime de la fina plato. NP estis eltirita de la intervertebra disko L1/2 per injektilo kaj injektita en ĝi. Borante truon en la subkondrala osto. La kirurgiaj proceduroj kaj boradmetodoj en la muskola enplantada grupo kaj la ŝajn-operacia grupo estis la samaj kiel tiuj en la NP-enplantada grupo. En la ME-grupo, peco de muskolo estis metita en la truon, dum en la ŝajn-operacia grupo, nenio estis metita en la truon. Post la operacio, MRI-skanado kaj molekula biologia testado estis faritaj. La signalo en la NPE-grupo ŝanĝiĝis, sed ne estis evidenta signalŝanĝo en la ŝajn-operacia grupo kaj la ME-grupo. Histologia observado montris, ke eksternorma histomultobliĝo estis observita ĉe la enplantadloko, kaj la esprimo de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ estis pliigita en la NPE-grupo. Enplantado de NP en la subkondralan oston povas formi bestan modelon de MC.
Modaj ŝanĝoj (MC) estas lezoj de la vertebraj finplatoj kaj apuda osta medolo videbla sur magneta resonanca bildigo (MRI). Ili estas sufiĉe oftaj ĉe individuoj kun rilataj simptomoj1. Multaj studoj emfazis la gravecon de MC pro ĝia asocio kun malalta malantaŭa doloro (LBP)2,3. de Roos et al.4 kaj Modic et al.5 sendepende unue priskribis tri malsamajn specojn de subkondralaj signalaj anomalioj en la vertebra osta medolo. Modikaj tipo I ŝanĝoj estas hipointensaj sur T1-pezitaj (T1W) sekvencoj kaj hiperintensaj sur T2-pezitaj (T2W) sekvencoj. Tiu lezo rivelas fendajn finplatojn kaj apudan angian grajnecan histon en la osta medolo. Modikaj tipo II-ŝanĝoj montras altan signalon sur kaj T1W kaj T2W-sekvencoj. En ĉi tiu speco de lezo, finplata detruo povas esti trovita, same kiel histologia grasanstataŭaĵo de la apuda osta medolo. Modikaj tipo III-ŝanĝoj montras malaltan signalon en T1W kaj T2W-sekvencoj. Sklerozaj lezoj respondaj al la finplatoj estis observitaj6. MC estas konsiderata patologia malsano de la spino kaj estas proksime rilata al multaj degeneraj malsanoj de la spino7,8,9.
Konsiderante la disponeblajn datumojn, pluraj studoj disponigis detalajn sciojn pri la etiologio kaj patologiaj mekanismoj de MC. Albert et al. sugestis, ke MC povas esti kaŭzita de disko-herniado8. Hu et al. atribuis MC al severa diskodegenero10. Kroc proponis la koncepton de "interna diskrompo", kiu deklaras ke ripetema disktraŭmato povas konduki al mikroŝiraĵoj en la finplato. Post fendoformacio, finplatdetruo de la nukleo pulposus (NP) povas ekigi aŭtoimunan respondon, kiu plue kondukas al la evoluo de MC11. Ma et al. dividis similan vidon kaj raportis, ke NP-induktita aŭtoimuneco ludas ŝlosilan rolon en la patogenezo de MC12.
Imunsistemaj ĉeloj, precipe CD4+ T helpaj limfocitoj, ludas kritikan rolon en la patogenezo de aŭtoimuneco13. La lastatempe malkovrita Th17-subaro produktas la proinflamatorian citokinon IL-17, antaŭenigas kemokinesprimon, kaj stimulas T-ĉelojn en difektitaj organoj por produkti IFN-γ14. Th2-ĉeloj ankaŭ ludas unikan rolon en la patogenezo de imunreagoj. Esprimo de IL-4 kiel reprezenta ĉelo Th2 povas konduki al severaj imunpatologiaj sekvoj15.
Kvankam multaj klinikaj studoj estis faritaj sur MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, ekzistas ankoraŭ manko de taŭgaj bestaj eksperimentaj modeloj kiuj povas imiti la MC-procezon kiu ofte okazas en homoj kaj povas esti. uzata por esplori la etiologion aŭ novajn traktadojn kiel celita terapio. Ĝis nun, nur kelkaj bestaj modeloj de MC estis raportitaj studi la subestajn patologiajn mekanismojn.
Surbaze de la aŭtoimuna teorio proponita de Albert kaj Ma, ĉi tiu studo establis simplan kaj reprodukteblan modelon de kuniklo MC per aŭtotransplantado de NP proksime de la borita vertebra finplato. Aliaj celoj estas observi la histologiajn karakterizaĵojn de la bestaj modeloj kaj taksi la specifajn mekanismojn de NP en la evoluo de MC. Tiucele, ni uzas teknikojn kiel ekzemple molekula biologio, MRI kaj histologiaj studoj por studi la progresadon de MC.
Du kunikloj mortis pro sangado dum kirurgio, kaj kvar kunikloj mortis dum anestezo dum MR. La ceteraj 48 kunikloj pluvivis kaj montris neniujn kondutismajn aŭ neŭrologiajn signojn post kirurgio.
MRI montras, ke la signala intenseco de la enigita histo en malsamaj truoj estas malsama. La signala intenseco de la L5-vertebra korpo en la NPE-grupo iom post iom ŝanĝiĝis je 12, 16 kaj 20 semajnoj post enmeto (T1W-sekvenco montris malaltan signalon, kaj T2W-sekvenco montris miksitan signalon plus malaltan signalon) (Fig. 1C), dum la MRI-aperoj. de la aliaj du grupoj de enigitaj partoj restis relative stabilaj dum la sama periodo (Fig. 1A, B).
(A) Reprezentaj sinsekvaj MRIoj de la kuniklolumba spino ĉe 3 tempopunktoj. Neniuj signalaj anomalioj estis trovitaj en la bildoj de la ŝajn-operacia grupo. (B) La signalaj trajtoj de la vertebra korpo en la ME-grupo estas similaj al tiuj en la ŝajn-operacia grupo, kaj neniu signifa signala ŝanĝo estas observata ĉe la enkonstrua loko laŭlonge de la tempo. (C) En la NPE-grupo, la malalta signalo estas klare videbla en la T1W-sekvenco, kaj la miksita signalo kaj malalta signalo estas klare videblaj en la T2W-sekvenco. De la 12-semajna periodo ĝis la 20-semajna periodo, la sporadaj altaj signaloj ĉirkaŭantaj la malaltajn signalojn en la T2W-sekvenco malpliiĝas.
Evidenta osta hiperplazio povas esti vidita ĉe la enplantiĝoloko de la vertebra korpo en la grupo NPE, kaj la osta hiperplazio okazas pli rapide de 12 ĝis 20 semajnoj (Fig. 2C) kompare kun la NPE-grupo, neniu signifa ŝanĝo estas observita en la modela vertebraro. korpoj; Ŝam-grupo kaj ME-grupo (Fig. 2C) 2A,B).
(A) La surfaco de la vertebra korpo ĉe la enplantita parto estas tre glata, la truo resaniĝas bone, kaj ne estas hiperplazio en la vertebra korpo. (B) La formo de la enplantita loko en la ME-grupo estas simila al tiu en la ŝajna operaciogrupo, kaj ne estas evidenta ŝanĝo en la aspekto de la enplantita loko laŭlonge de la tempo. (C) Osta hiperplazio okazis ĉe la enplantita loko en la NPE-grupo. La osta hiperplazio pliiĝis rapide kaj eĉ etendiĝis tra la intervertebra disko al la kontraŭflanka vertebra korpo.
Histologia analizo disponigas pli detalajn informojn pri ostformado. Figuro 3 montras la fotojn de la postoperaciaj sekcioj makulitaj per H&E. En la grupo de falsa operacio, la kondrocitoj estis bone aranĝitaj kaj neniu ĉela proliferado estis detektita (Fig. 3A). La situacio en la ME-grupo estis simila al tiu en la ŝajn-operacia grupo (Fig. 3B). Tamen, en la NPE-grupo, granda nombro da kondrocitoj kaj proliferado de NP-similaj ĉeloj estis observitaj ĉe la enplantiĝoloko (Fig. 3C);
(A) Trabeculae povas esti viditaj proksime de la finplato, la kondrocitoj estas bonorde aranĝitaj kun unuforma ĉela grandeco kaj formo kaj neniu proliferado (40 fojojn). (B) La kondiĉo de la enplanta loko en la ME-grupo estas simila al tiu de la ŝajngrupo. Trabeculae kaj kondrocitoj povas esti viditaj, sed ekzistas neniu evidenta proliferado ĉe la enplantadloko (40 fojojn). (B) Oni povas vidi, ke kondrocitoj kaj NP-similaj ĉeloj signife multiĝas, kaj la formo kaj grandeco de kondrocitoj estas neegala (40 fojojn).
La esprimo de interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA, kaj interferon γ (IFN-γ) mRNA estis observita en kaj la NPE kaj ME-grupoj. Kiam la esprimniveloj de celaj genoj estis komparitaj, la genesprimoj de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ estis signife pliigitaj en la NPE-grupo kompare kun tiuj de la ME-grupo kaj la ŝajna operaciogrupo (Fig. 4) (P < 0,05). Kompare kun la ŝajna operaciogrupo, la esprimniveloj de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ en la ME-grupo pliiĝis nur iomete kaj ne atingis statistikan ŝanĝon (P> 0.05).
La mRNA-esprimo de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ en la NPE-grupo montris signife pli altan tendencon ol tiuj en la ŝajna operaciogrupo kaj la ME-grupo (P <0.05).
Kontraste, la esprimniveloj en la ME-grupo montris neniun signifan diferencon (P>0.05).
Western blot-analizo estis farita uzante komerce haveblajn antikorpojn kontraŭ IL-4 kaj IL-17 por konfirmi la ŝanĝitan mRNA-esprimpadronon. Kiel montrite en Figuroj 5A,B, kompare kun la ME-grupo kaj la ŝajna operaciogrupo, la proteinaj niveloj de IL-4 kaj IL-17 en la NPE-grupo estis signife pliigitaj (P <0.05). Kompare kun la ŝajna operaciogrupo, la proteinniveloj de IL-4 kaj IL-17 en la ME-grupo ankaŭ ne atingis statistike signifajn ŝanĝojn (P> 0.05).
(A) La proteinaj niveloj de IL-4 kaj IL-17 en la NPE-grupo estis signife pli altaj ol tiuj en la ME-grupo kaj placebo-grupo (P <0.05). (B) Western blot histogramo.
Pro la limigita nombro da homaj specimenoj akiritaj dum kirurgio, klaraj kaj detalaj studoj pri la patogenezo de MC estas iom malfacilaj. Ni provis establi bestan modelon de MC por studi ĝiajn eblajn patologiajn mekanismojn. Samtempe, radiologia taksado, histologia taksado kaj molekula biologia taksado estis uzataj por sekvi la kurson de MC induktita de NP-aŭtogrefto. Kiel rezulto, la NP-enplantadmodelo rezultigis laŭpaŝan ŝanĝon en signalintenseco de 12-semajnaj ĝis 20-semajnaj tempopunktoj (miksita malalta signalo en T1W-sekvencoj kaj malalta signalo en T2W-sekvencoj), indikante histajn ŝanĝojn, kaj la histologiajn kaj molekulajn. biologiaj taksadoj konfirmis la rezultojn de la radiologia studo.
La rezultoj de ĉi tiu eksperimento montras, ke vidaj kaj histologiaj ŝanĝoj okazis ĉe la loko de malobservo de vertebra korpo en la grupo NPE. Samtempe, la esprimo de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ-genoj, same kiel IL-4, IL-17 kaj IFN-γ estis observita, indikante, ke la malobservo de aŭtologa kerno pulposus histo en la vertebraro. korpo povas kaŭzi serion de signalo kaj morfologiaj ŝanĝoj. Estas facile trovi, ke la signalaj trajtoj de la vertebraj korpoj de la besta modelo (malalta signalo en la T1W-sekvenco, miksita signalo kaj malalta signalo en la T2W-sekvenco) estas tre similaj al tiuj de homaj vertebraj ĉeloj, kaj la MR-aj trajtoj ankaŭ konfirmu la observojn de histologio kaj malpura anatomio, tio estas, la ŝanĝoj en la vertebraj korpoĉeloj estas progresemaj. Kvankam la inflama respondo kaŭzita de akra traŭmato povas aperi baldaŭ post trapiko, MRI-rezultoj montris, ke laŭstadie kreskantaj signalŝanĝoj aperis 12 semajnojn post trapiko kaj daŭris ĝis 20 semajnojn sen iuj signoj de reakiro aŭ inversigo de MRI-ŝanĝoj. Tiuj rezultoj indikas ke aŭtologa vertebra NP estas fidinda metodo por establado de progresema MV en kunikloj.
Ĉi tiu trapikmodelo postulas taŭgan kapablon, tempon kaj kirurgian fortostreĉon. En preparaj eksperimentoj, dissekcio aŭ troa stimulo de la paravertebraj ligamentaj strukturoj povas rezultigi la formadon de vertebraj osteofitos. Oni devas zorgi por ne difekti aŭ iriti la apudajn diskojn. Ĉar la profundo de penetrado devas esti kontrolita por akiri konsekvencajn kaj reprodukteblajn rezultojn, ni mane faris ŝtopilon per tranĉado de la ingo de 3 mm longa kudrilo. Uzado de ĉi tiu ŝtopilo certigas unuforman boran profundon en la vertebra korpo. En preparaj eksperimentoj, tri ortopediaj kirurgoj implikitaj en la operacio trovis 16-mezurajn pinglojn pli facile labori per ol 18-mezuraj pingloj aŭ aliaj metodoj. Por eviti troan sangadon dum borado, teni la kudrilon senmove dum iom da tempo provizos pli taŭgan enmeta truon, sugestante ke certa grado da MC povas esti kontrolita tiamaniere.
Kvankam multaj studoj celis MC, oni scias malmulte pri la etiologio kaj patogenezo de MC25,26,27. Surbaze de niaj antaŭaj studoj, ni trovis, ke aŭtoimuneco ludas ŝlosilan rolon en la apero kaj disvolviĝo de MC12. Ĉi tiu studo ekzamenis la kvantan esprimon de IL-4, IL-17, kaj IFN-γ, kiuj estas la ĉefaj diferencigaj vojoj de CD4+-ĉeloj post antigena stimulo. En nia studo, kompare kun la negativa grupo, la NPE-grupo havis pli altan esprimon de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ, kaj la proteinaj niveloj de IL-4 kaj IL-17 ankaŭ estis pli altaj.
Klinike, IL-17-mRNA-esprimo pliiĝas en NP-ĉeloj de pacientoj kun diskherniado28. Pliigitaj esprimniveloj de IL-4 kaj IFN-γ ankaŭ estis trovitaj en akra ne-kunprema disko-herniado-modelo kompare kun sanaj kontroloj29. IL-17 ludas ŝlosilan rolon en inflamo, hista vundo en aŭtoimunaj malsanoj30 kaj plibonigas la imunreagon al IFN-γ31. Plifortigita IL-17-mediaciita histo-vundo estis raportita en MRL/lpr musoj32 kaj aŭtoimune-sendeblaj musoj33. IL-4 povas malhelpi la esprimon de proinflamaj citokinoj (kiel ekzemple IL-1β kaj TNFα) kaj makrofagan aktivigon34. Estis raportite ke la mRNA-esprimo de IL-4 estis malsama en la NPE-grupo kompare kun IL-17 kaj IFN-γ en la sama tempopunkto; La mRNA-esprimo de IFN-γ en la NPE-grupo estis signife pli alta ol tiu en la aliaj grupoj. Tial, IFN-γ-produktado povas esti mediaciisto de la inflama respondo induktita per NP-interkalado. Studoj montris, ke IFN-γ estas produktita de multoblaj ĉeltipoj, inkluzive de aktivigitaj tipo 1 helpantaj T-ĉeloj, naturaj mortigaj ĉeloj kaj makrofagoj35,36, kaj estas ŝlosila porinflama citokino, kiu antaŭenigas imunajn respondojn37.
Ĉi tiu studo sugestas, ke aŭtoimuna respondo povas esti implikita en la okazo kaj evoluo de MC. Luoma et al. trovis, ke la signalaj trajtoj de MC kaj elstara NP estas similaj ĉe MRI, kaj ambaŭ montras altan signalon en T2W-sekvenco38. Kelkaj citokinoj estis konfirmitaj esti proksime rilataj al la okazo de MC, kiel ekzemple IL-139. Ma et al. sugestis, ke la supren aŭ malsupren elstaraĵo de NP povas havi grandan influon sur la okazo kaj evoluo de MC12. Bobechko40 kaj Herzbein et al.41 raportis, ke NP estas imunotolerema histo, kiu ne povas eniri la vaskulan cirkuladon de naskiĝo. NP-elstaraĵoj enkondukas fremdajn korpojn en la sangoprovizon, tiel perante lokajn aŭtoimunajn reagojn42. Aŭtoimunaj reagoj povas indukti grandan nombron da imunaj faktoroj, kaj kiam ĉi tiuj faktoroj estas senĉese elmontritaj al histoj, ili povas kaŭzi ŝanĝojn en signalado43. En ĉi tiu studo, troesprimo de IL-4, IL-17 kaj IFN-γ estas tipaj imunfaktoroj, plue pruvante la proksiman rilaton inter NP kaj MCs44. Tiu besta modelo bone imitas la NP-sukceson kaj eniron en la finplaton. Ĉi tiu procezo plue rivelis la efikon de aŭtoimuneco sur MC.
Kiel atendite, ĉi tiu besta modelo provizas al ni eblan platformon por studi MC. Tamen, ĉi tiu modelo ankoraŭ havas kelkajn limigojn: unue, dum la fazo de observado de bestoj, kelkaj mezfazaj kunikloj devas esti eutanigitaj por histologia kaj molekula biologia testado, do iuj bestoj "falas sen uzo" kun la tempo. Due, kvankam tri tempopunktoj estas fiksitaj en ĉi tiu studo, bedaŭrinde, ni nur modeligis unu tipon de MC (Modic-tipo I-ŝanĝo), do ne sufiĉas reprezenti la homan malsanan evoluprocezon, kaj pli da tempopunktoj devas esti agordita al. pli bone observu ĉiujn signalŝanĝojn. Trie, la ŝanĝoj en histostrukturo ja povas esti klare montritaj per histologia makulado, sed iuj specialigitaj teknikoj povas pli bone malkaŝi la mikrostrukturajn ŝanĝojn en ĉi tiu modelo. Ekzemple, polarigita lummikroskopio estis uzata por analizi la formadon de fibrokartilago en kuniklo-intervertebraj diskoj45. La longperspektivaj efikoj de NP sur MC kaj finplato postulas plian studon.
Kvindek kvar masklaj Nov-Zelandaj blankaj kunikloj (pezo ĉirkaŭ 2.5-3 kg, aĝo 3-3.5 monatoj) estis hazarde dividitaj en ŝajnoperacian grupon, muskolajn enplantadgrupon (ME-grupon) kaj nervradikan enplantadgrupon (NPE-grupon). Ĉiuj eksperimentaj proceduroj estis aprobitaj de la Etika Komitato de Tianjin Hospitalo, kaj la eksperimentaj metodoj estis faritaj en strikta konforme al la aprobitaj gvidlinioj.
Kelkaj plibonigoj estis faritaj al la kirurgia tekniko de S. Sobajima 46 . Ĉiu kuniklo estis metita en lateralan kuŝan pozicion kaj la antaŭa surfaco de kvin sinsekvaj lumbalaj intervertebraj diskoj (IVD) estis elmontrita per posterolateral retroperitoneal aliro. Ĉiu kuniklo ricevis ĝeneralan anestezon (20% uretano, 5 ml/kg per la orelvejno). Longituda haŭta incizo estis farita de la malsupra rando de la ripoj ĝis la pelva rando, 2 cm ventrale al la paravertebraj muskoloj. La dekstra anterolateral spino de L1 al L6 estis elmontrita per akra kaj malakra dissekcio de la supra subkutana histo, retroperitoneal histo kaj muskoloj (Fig. 6A). La disko-nivelo estis determinita uzante la pelvan randon kiel anatomian orientilon por la L5-L6-diska nivelo. Uzu 16-mezuran trapikan kudrilon por bori truon proksime de la finplato de la L5-vertebro ĝis profundo de 3 mm (Fig. 6B). Uzu 5-ml injektilon por aspiri la aŭtologa nukleo pulposus en la intervertebra disko L1-L2 (Fig. 6C). Forigu la nukleon pulposus aŭ muskolon laŭ la postuloj de ĉiu grupo. Post kiam la borilo estas profundigita, sorbeblaj suturoj estas metitaj sur la profundan fascion, malprofundan fascion kaj haŭton, zorgante ne damaĝi la periostan histon de la vertebra korpo dum kirurgio.
(A) La L5-L6-disko estas elmontrita per posteroflanka retroperitonea aliro. (B) Uzu 16-mezuran kudrilon por bori truon proksime de la L5-finplato. (C) Aŭtologoj MF-oj estas rikoltaj.
Ĝenerala anestezo estis administrita kun 20% uretano (5 ml/kg) administrita per la orelvejno, kaj lumbaj spinaj radiografioj estis ripetitaj ĉe 12, 16, kaj 20 semajnoj postoperacie.
Kunikloj estis oferitaj per intramuskola injekto de ketamina (25.0 mg/kg) kaj intravejna natria pentobarbitalo (1.2 g/kg) je 12, 16 kaj 20 semajnoj post kirurgio. La tuta spino estis forigita por histologia analizo kaj reala analizo estis farita. Kvanta inversa transskribo (RT-qPCR) kaj okcidenta makulado estis uzataj por detekti ŝanĝojn en imunfaktoroj.
MRI-ekzamenoj estis faritaj en kunikloj per 3.0 T klinika magneto (GE Medical Systems, Florence, SC) ekipita per orta membro-volvaĵricevilo. Kunikloj estis anestezitaj kun 20% uretano (5 mL/kg) per la orelvejno kaj tiam metitaj dorse ene de la magneto kun la lumba regiono centrita sur 5-cola diametra cirkla surfacvolvaĵo (GE Medical Systems). Koronaj T2-pezitaj lokalizilaj bildoj (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) estis akiritaj por difini la lokon de la lumba disko de L3-L4 ĝis L5-L6. Sagitalaj ebenaj T2-pezitaj tranĉaĵoj estis akiritaj kun la sekvaj agordoj: rapida spin-eĥa sekvenco kun ripeta tempo (TR) de 2200 ms kaj eĥotempo (TE) de 70 ms, matrico; vida kampo de 260 kaj ok stimuloj; La tranĉa dikeco estis 2 mm, la breĉo estis 0.2 mm.
Post kiam la lasta foto estis prenita kaj la lasta kuniklo estis senvivigita, la ŝajnigaj, muskol-enigitaj, kaj NP-diskoj estis forigitaj por histologia ekzameno. Ŝtofoj estis fiksitaj en 10% neŭtrala bufrita formalino dum 1 semajno, senkalciigitaj kun etilendiaminotetraaceta acido, kaj sekciitaj parafino. Histoblokoj estis enigitaj en parafino kaj tranĉitaj en sagitalaj sekcioj (5 μm dikaj) uzante mikrotomon. Sekcioj estis makulitaj per hematoksilino kaj eozino (H&E).
Post kolektado de la intervertebraj diskoj de la kunikloj en ĉiu grupo, totala RNA estis ĉerpita uzante UNIQ-10-kolumnon (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Ĉinio) laŭ la instrukcioj de la produktanto kaj ImProm II inversa transskriba sistemo (Promega Inc. , Madison, WI, Usono). Inversa transskribo estis farita.
RT-qPCR estis farita uzante Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., Usono) kaj SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Usono) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto. La PCR-reagvolumeno estis 20 μl kaj enhavis 1.5 μl de diluita cDNA kaj 0.2 μM de ĉiu enkonduko. Primeroj estis desegnitaj de OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencio, CA) kaj fabrikitaj de Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Ĉinio) (Tabelo 1). La sekvaj termikaj biciklaj kondiĉoj estis uzataj: komenca aktivigo de polimerazo je 94 °C dum 2 minutoj, tiam 40 cikloj de 15 s ĉiu je 94 °C por ŝablondenaturado, kalzigado dum 1 minuto je 60 °C, etendo kaj fluoreskeco. mezuradoj estis faritaj dum 1 minuto je 72 °C. Ĉiuj specimenoj estis plifortigitaj tri fojojn kaj la averaĝa valoro estis uzata por analizo de RT-qPCR. Plifortigaj datumoj estis analizitaj per FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Usono). IL-4, IL-17, kaj IFN-γ genekspresio estis normaligitaj al la endogena kontrolo (ACTB). Relativaj esprimniveloj de cela mRNA estis kalkulitaj per la 2-ΔΔCT-metodo.
Totala proteino estis ĉerpita el histoj uzante histan homogenizilon en RIPA-lizo-bufro (enhavanta proteazon kaj fosfatazinhibidan koktelon) kaj tiam centrifuĝita je 13,000 rpm dum 20 minutoj je 4 °C por forigi histajn derompaĵojn. Kvindek mikrogramoj da proteino estis ŝarĝitaj per leno, apartigitaj per 10% SDS-PAGE, kaj tiam transdonitaj al PVDF-membrano. Blokado estis farita en 5% negrasa seka lakto en Tris-bufrita salo (TBS) enhavanta 0.1% Tween 20 dum 1 h ĉe ĉambra temperaturo. La membrano estis kovita kun kuniklo kontraŭ-decorina primara antikorpo (diluita 1:200; Boster, Wuhan, Ĉinio) (diluita 1:200; Bioss, Pekino, Ĉinio) dum la nokto je 4 °C kaj reagis en la duaj tagoj; kun malĉefa antikorpo (kapra kontraŭkuniklo imunoglobulino G je 1:40,000 diluo) kombinita kun bena peroksidazo (Boster, Wuhan, Ĉinio) dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo. Okcidentaj blotsignaloj estis detektitaj per pliigita kemiluminesko sur la kemilumineska membrano post Rentgenfota surradiado. Por densitometra analizo, makuloj estis skanitaj kaj kvantigitaj uzante BandScan-softvaron kaj la rezultoj estis esprimitaj kiel la rilatumo de celgena imunoreaktiveco al tubulina imunoreaktiveco.
Statistikaj kalkuloj estis faritaj per la programaro SPSS16.0 (SPSS, Usono). Datumoj kolektitaj dum la studo estis esprimitaj kiel meznombro ± norma devio (meznombro ± SD) kaj analizitaj uzante unudirektan ripetajn mezurajn analizon de varianco (ANOVA) por determini diferencojn inter la du grupoj. P <0.05 estis konsiderita statistike signifa.
Tiel, la establado de besta modelo de MC per enplantado de aŭtologoj NP-oj en la vertebran korpon kaj farado de makroanatomia observado, MRI-analizo, histologia taksado kaj molekula biologia analizo povas iĝi grava ilo por taksi kaj kompreni la mekanismojn de homa MC kaj disvolvi novajn terapiajn. intervenoj.
Kiel citi ĉi tiun artikolon: Han, C. et al. Besta modelo de Modic-ŝanĝoj estis establita enplantante aŭtologa nukleo pulposus en la subkondralan oston de la lumba spino. Sci. Rep 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., kaj Boos, N. Magneta resonanca bildigo de la lumba spino: tropezo de diskherniado kaj reteno, nervradika kunpremo, finplataj anomalioj kaj faceta artika osteoartrito en sensimptomaj volontuloj. . imposto. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, kaj Leboeuf-Eed, K. Modic-ŝanĝoj kaj ilia rilato al klinikaj trovoj. European Spine Journal: oficiala publikigo de la Eŭropa Spina Societo, la Eŭropa Socio de Spina Misformaĵo, kaj la Eŭropa Socio por Cervical Spine Research 15, 1312-1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modikaj ŝanĝoj en la lumbaj vertebraj finplatoj: tropezo kaj asocio kun malalta malantaŭa doloro kaj kiatiko en mezaĝaj viraj laboristoj. Spino 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., kaj Dalinka, M. MRI de osta medolo ŝanĝiĝas proksime de la fina plato en degenera malsano de la lumba spino. AJR. Amerika Ĵurnalo de Radiologio 149, 531-534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, kaj Carter, JR Degenera diskmalsano: taksado de vertebra medolo-ŝanĝoj kun MRI. Radiology 166, 193-199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, kaj Carter, JR Bildigo de degenera disko-malsano. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Antaŭdiroj de novvertebra finplato (Modic) signalas ŝanĝojn en la ĝenerala populacio. European Spine Journal: Oficiala Publikigo de la Eŭropa Spina Societo, la Eŭropa Socio de Spina Deformaĵo, kaj la Eŭropa Socio por Cervical Spine Research, Division 19, 129-135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB kaj Mannisch, K. Modic ŝanĝoj post lumba disko herniado. European Spine Journal : Oficiala Publikigo de la Eŭropa Spina Societo, la Eŭropa Socio de Spina Deformiĝo kaj la Eŭropa Socio por Cervical Spine Research 16, 977-982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., kaj Kaapa, E. Modic-tipo I-ŝanĝoj povas antaŭdiri rapide progreseman deforman diskon-degeneron: 1-jara eventuala studo. European Spine Journal 21, 1135-1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ kaj Fan, SW Modic-ŝanĝoj: eblaj kaŭzoj kaj kontribuo al lumba disko-degenerado. Medicinaj Hipotezoj 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Interna disko rompo. Diskoprolapso problemoj dum 50 jaroj. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650-653 (1986).
Afiŝtempo: Dec-13-2024