Dankon pro via vizito al nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas uzi la plej novan retumilversion (aŭ malŝalti kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Plie, por certigi daŭran subtenon, ĉi tiu retejo estos libera de stiloj kaj JavaScript.
Skeletmuskolo estas heterogena histo konsistanta ĉefe el miofibriloj, kiuj ĉe homoj estas tipe klasifikitaj en tri tipojn: unu "malrapida" (tipo 1) kaj du "rapidaj" (tipoj 2A kaj 2X). Tamen, diverseco inter kaj ene de tradiciaj miofibrilaj tipoj restas malbone komprenata. Ni aplikis transkriptomikajn kaj proteomikajn alirojn al 1050 kaj 1038 individuaj miofibriloj de homa vastus lateralis, respektive. La proteomika studo inkluzivis virojn, kaj la transkriptomika studo inkluzivis 10 virojn kaj 2 virinojn. Aldone al izoformoj de miozina peza ĉeno, ni identigis metabolajn proteinojn, ribosomajn proteinojn kaj ĉelajn ligproteinojn kiel fontojn de multdimensia intermiofibrila ŝanĝebleco. Krome, malgraŭ la identigo de aretoj de malrapidaj kaj rapidaj fibroj, niaj datumoj sugestas, ke tipo 2X fibroj estas fenotipe nedistingeblaj de aliaj rapid-konvulsiaj fibroj. Krome, klasifiko bazita sur miozina peza ĉeno ne sufiĉas por priskribi la miofibran fenotipon en nemalinaj miopatioj. Ĝenerale, niaj datumoj sugestas plurdimensian diversecon de miofibraj, kun fontoj de vario etendiĝantaj preter la izoformoj de la peza ĉeno de miozino.
Ĉela diverseco estas eneca trajto de ĉiuj biologiaj sistemoj, permesante al ĉeloj specialiĝi por plenumi la malsamajn bezonojn de histoj kaj ĉeloj.1 La tradicia vidpunkto pri diverseco de skeletmuskolaj fibroj estis, ke motorneŭronoj difinas la fibrotipon ene de motora unuo, kaj ke fibrotipo (t.e., tipo 1, tipo 2A, kaj tipo 2X en homoj) estas determinita de la karakterizaĵoj de miozinaj pezaj ĉenoj (MYH) izoformoj.2 Ĉi tio komence baziĝis sur ilia pH-ATPaza malstabileco,3,4 kaj poste sur ilia molekula esprimo de MYH.5 Tamen, kun la identigo kaj posta akcepto de "miksitaj" fibroj, kiuj kunesprimas plurajn MYH-ojn en diversaj proporcioj, skeletmuskolaj fibroj estas ĉiam pli vidataj kiel kontinuumo prefere ol kiel apartaj fibrotipoj.6 Malgraŭ tio, la kampo ankoraŭ multe dependas de MYH kiel la ĉefa klasifikilo por miofibra klasifiko, vidpunkto verŝajne influita de la limigoj kaj signifaj biasoj de fruaj ronĝulaj studoj, kies MYH-esprimprofiloj kaj gamo de fibrotipoj diferencas de tiuj en homoj.2 La situacio estas plue komplika pro la fakto, ke malsamaj homaj skeletmuskoloj montras diversan gamon de fibrotipoj.7 La vastus lateralis estas miksita muskolo kun meza (kaj tial reprezenta) MYH-esprimprofilo.7 Krome, ĝia facileco de specimenigo igas ĝin la plej bone studita muskolo en homoj.
Tiel, senantaŭjuĝa esplorado de la diverseco de skeletmuskolfibroj uzante potencajn "omikajn" ilojn estas kritika sed ankaŭ malfacila, parte pro la multnuklea naturo de skeletmuskolfibroj. Tamen, transkriptomiko8,9 kaj proteomiko10 teknologioj spertis revolucion en sentemo en la lastaj jaroj pro diversaj teknologiaj progresoj, permesante la analizon de skeletmuskolo je unu-fibra rezolucio. Rezulte, signifa progreso estis farita en la karakterizado de unu-fibra diverseco kaj ilia respondo al atrofiaj stimuloj kaj maljuniĝo11,12,13,14,15,16,17,18. Grave, ĉi tiuj teknologiaj progresoj havas klinikajn aplikojn, permesante pli detalan kaj precizan karakterizadon de malsan-rilata disregulado. Ekzemple, la patofiziologio de nemalina miopatio, unu el la plej oftaj hereditaj muskolmalsanoj (MIM 605355 kaj MIM 161800), estas kompleksa kaj konfuza.19,20 Tial, pli bona karakterizado de la disregulado de skeletmuskolfibroj povus konduki al signifaj progresoj en nia kompreno de ĉi tiu malsano.
Ni evoluigis metodojn por transkriptoma kaj proteoma analizo de unuopaj skeletmuskolfibroj mane izolitaj de homaj biopsiaj specimenoj kaj aplikis ilin al miloj da fibroj, permesante al ni esplori la ĉelan diversecon de homaj skeletmuskolfibroj. Dum ĉi tiu laboro, ni montris la potencon de transkriptoma kaj proteoma fenotipado de muskolfibroj kaj identigis metabolajn, ribosomajn kaj ĉelajn jungaĵajn proteinojn kiel signifajn fontojn de interfibra ŝanĝebleco. Krome, uzante ĉi tiun proteoman laborfluon, ni karakterizis la klinikan gravecon de nematoda miopatio en unuopaj skeletmuskolfibroj, rivelante kunordigitan ŝanĝon al ne-oksidivaj fibroj sendepende de fibrotipo bazita sur myopatio.
Por esplori la diversecon de homaj skeletmuskolaj fibroj, ni evoluigis du laborfluojn por ebligi transkriptoman kaj proteoman analizon de unuopaj skeletmuskolaj fibroj (Figuro 1A kaj Aldona Figuro 1A). Ni evoluigis kaj optimumigis plurajn metodologiajn paŝojn, de specimenstokado kaj konservado de RNA kaj proteina integreco ĝis optimumigo de trairo por ĉiu aliro. Por transkriptoma analizo, ĉi tio estis atingita per enmeto de specimen-specifaj molekulaj strekkodoj ĉe la komenca paŝo de inversa transskribo, permesante kunigi 96 fibrojn por efika postflua prilaborado. Pli profunda sekvencado (±1 miliono da legaĵoj por fibro) kompare kun tradiciaj unuĉelaj aliroj plue riĉigis la transkriptomajn datumojn.21 Por proteomiko, ni uzis mallongan kromatografian gradienton (21 minutoj) kombinitan kun DIA-PASEF-datuma akiro sur timsTOF-masspektrometro por optimumigi proteoman profundon, konservante altan trairon. 22,23 Por esplori la diversecon de sanaj skeletmuskolaj fibroj, ni karakterizis la transkriptomojn de 1 050 individuaj fibroj de 14 sanaj plenkreskaj donacantoj kaj la proteomojn de 1 038 fibroj de 5 sanaj plenkreskaj donacantoj (Aldona Tabelo 1). En ĉi tiu artikolo, ĉi tiuj datumaroj estas nomataj la 1 000-fibraj transkriptomoj kaj proteomoj, respektive. Nia aliro detektis entute 27 237 transkriptojn kaj 2 983 proteinojn en la 1 000-fibraj transkriptomaj kaj proteomaj analizoj (Figuro 1A, Aldonaj Datumaroj 1-2). Post filtrado de la transkriptomaj kaj proteomaj datumaroj por >1 000 detektitaj genoj kaj 50% validaj valoroj por fibro, postaj bioinformadikaj analizoj estis faritaj por 925 kaj 974 fibroj en la transkriptomo kaj proteomo, respektive. Post filtrado, averaĝe 4257 ± 1557 genoj kaj 2015 ± 234 proteinoj (meznombro ± norma devio) estis detektitaj por ĉiu fibro, kun limigita interindividua ŝanĝiĝemo (Aldonaj Figuroj 1B-C, Aldonaj Datumoj 3-4). Tamen, ene de la subjekta ŝanĝiĝemo estis pli okulfrapa inter partoprenantoj, verŝajne pro diferencoj en RNA/proteina rendimento inter fibroj de malsamaj longoj kaj transversaj sekcaj areoj. Por plej multaj proteinoj (>2000), la koeficiento de vario estis sub 20% (Aldonaj Figuroj 1D). Ambaŭ metodoj permesis kapti larĝan dinamikan gamon da transskribaĵoj kaj proteinoj kun tre esprimitaj signaturoj gravaj por muskola kuntiriĝo (ekz., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Aldonaj Figuroj 1E-F). La plej multaj el la identigitaj trajtoj estis komunaj inter la transkriptomaj kaj proteomaj datumaroj (Aldona Figuro 1G), kaj la averaĝaj UMI/LFQ-intensecoj de ĉi tiuj trajtoj estis sufiĉe bone korelaciitaj (r = 0.52) (Aldona Figuro 1H).
Transkriptomiko kaj proteomika laborfluo (kreita per BioRender.com). BD Dinamikaj intervalkurboj por MYH7, MYH2, kaj MYH1, kaj kalkulitaj sojloj por asigno de fibrotipo. E, F Distribuo de MYH-esprimo tra fibroj en transkriptomiko kaj proteomikaj datumaroj. G, H Uniforma Diverseca Aproksimado kaj Projekcio (UMAP) grafikaĵoj por transkriptomiko kaj proteomikko kolorigitaj laŭ MYH-bazita fibrotipo. I, J Trajtaj grafikaĵoj montrantaj la esprimon de MYH7, MYH2, kaj MYH1 en transkriptomiko kaj proteomikaj datumaroj.
Ni komence celis asigni MYH-bazitan fibrotipon al ĉiu fibro uzante optimumigitan aliron, kiu utiligas la altan sentemon kaj dinamikan gamon de MYH-esprimo en omikaj datumaroj. Antaŭaj studoj uzis arbitrajn sojlojn por etikedi fibrojn kiel pura tipo 1, tipo 2A, tipo 2X, aŭ miksitaj surbaze de fiksa procento de esprimo de malsamaj MYH-oj11,14,24. Ni uzis malsaman aliron, en kiu la esprimo de ĉiu fibro estis rangigita laŭ la MYH-oj, kiujn ni uzis por tipi la fibrojn: MYH7, MYH2, kaj MYH1, respondantaj al tipo 1, tipo 2A, kaj tipo 2X fibroj, respektive. Ni tiam matematike kalkulis la pli malaltan fleksiopunkton de ĉiu rezulta kurbo kaj uzis ĝin kiel sojlon por asigni fibrojn kiel pozitivajn (super la sojlo) aŭ negativajn (sub la sojlo) por ĉiu MYH (Figuro 1B-D). Ĉi tiuj datumoj montras, ke MYH7 (Figuro 1B) kaj MYH2 (Figuro 1C) havas pli apartajn ŝaltitajn/malŝaltitajn esprimajn profilojn je la RNA-nivelo kompare kun la proteina nivelo. Efektive, je la proteina nivelo, tre malmultaj fibroj ne esprimis MYH7, kaj neniu fibro havis 100% MYH2-esprimon. Ni poste uzis antaŭdifinitajn esprimajn sojlojn por asigni MYH-bazitajn fibrotipojn al ĉiuj fibroj en ĉiu datumbazo. Ekzemple, MYH7+/MYH2-/MYH1- fibroj estis asignitaj al tipo 1, dum MYH7-/MYH2+/MYH1+ fibroj estis asignitaj al miksita tipo 2A/2X (vidu Aldonan Tabelon 2 por plena priskribo). Kolektante ĉiujn fibrojn, ni observis rimarkinde similan distribuon de MYH-bazitaj fibrotipoj je kaj la RNA (Figuro 1E) kaj la proteina (Figuro 1F) niveloj, dum la relativa konsisto de MYH-bazitaj fibrotipoj variis inter individuoj, kiel atendite (Aldonan Figuron 2A). La plej multaj fibroj estis klasifikitaj kiel aŭ pura tipo 1 (34–35%) aŭ tipo 2A (36–38%), kvankam signifa nombro da miksitaj tipo 2A/2X fibroj ankaŭ estis detektita (16–19%). Frapa diferenco estas, ke puraj tipo 2X fibroj povus esti detektitaj nur je la RNA-nivelo, sed ne je la proteinnivelo, sugestante, ke rapida MYH-esprimo estas almenaŭ parte reguligita post-transkriptie.
Ni validigis nian proteomik-bazitan MYH-fibro-tipigan metodon uzante antikorp-bazitan punktomakumadon, kaj ambaŭ metodoj atingis 100% kongruon en identigado de puraj tipo 1 kaj tipo 2A fibroj (vidu Suplementan Figuron 2B). Tamen, la proteomik-bazita aliro estis pli sentema, pli efika en identigado de miksitaj fibroj, kaj kvantigado de la proporcio de ĉiu MYH-geno en ĉiu fibro. Ĉi tiuj datumoj montras la efikecon de uzado de objektiva, tre sentema omiko-bazita aliro por karakterizi skeletmuskolfibro-tipojn.
Ni poste uzis la kombinitajn informojn provizitajn de transkriptomiko kaj proteomiko por objektive klasifiki miofibrojn surbaze de ilia kompleta transkriptomo aŭ proteomo. Uzante la metodon de unuforma multnombra aproksimado kaj projekcio (UMAP) por redukti la dimensiecon al ses ĉefaj komponantoj (Aldonaj Figuroj 3A-B), ni povis bildigi miofibran ŝanĝiĝemon en la transkriptomo (Figuro 1G) kaj proteomo (Figuro 1H). Rimarkinde, miofibroj ne estis grupigitaj laŭ partoprenantoj (Aldonaj Figuroj 3C-D) aŭ testaj tagoj (Aldonaj Figuroj 3E) en nek la transkriptomikaj nek la proteomikaj datumaroj, sugestante, ke ene de subjekta ŝanĝiĝemo en skeletmuskolaj fibroj estas pli alta ol intersubjekta ŝanĝiĝemo. En la UMAP-diagramo, aperis du apartaj aretoj reprezentantaj "rapidajn" kaj "malrapidajn" miofibrojn (Figuroj 1G-H). MYH7+ (malrapidaj) miofibroj estis grupigitaj ĉe la pozitiva poluso de UMAP1, dum MYH2+ kaj MYH1+ (rapidaj) miofibroj estis grupigitaj ĉe la negativa poluso de UMAP1 (Figuroj 1I-J). Tamen, neniu distingo estis farita inter rapid-konvulsiaj fibrotipoj (t.e., tipo 2A, tipo 2X, aŭ miksita 2A/2X) surbaze de MYH-esprimo, sugestante ke la esprimo de MYH1 (Figuro 1I-J) aŭ aliaj klasikaj 2X miofibraj markiloj kiel ACTN3 aŭ MYLK2 (Aldonaj Figuroj 4A-B) ne diferencigas inter malsamaj miofibraj tipoj kiam oni konsideras la tutan transkriptomon aŭ proteomon. Krome, kompare kun MYH2 kaj MYH7, malmultaj transkriptoj aŭ proteinoj estis pozitive korelaciitaj kun MYH1 (Aldonaj Figuroj 4C-H), sugestante ke la abundo de MYH1 ne plene reflektas la miofibran transkriptomon/proteomon. Similaj konkludoj estis atingitaj dum taksado de la miksita esprimo de la tri MYH-izoformoj je la UMAP-nivelo (Aldonaj Figuroj 4I-J). Tiel, dum 2X-fibroj povas esti identigitaj je la transskribaĵnivelo surbaze de MYH-kvantigo sole, MYH1+-fibroj ne estas distingeblaj de aliaj rapidaj fibroj kiam oni konsideras la tutan transskribaĵon aŭ proteomon.
Kiel komenca esplorado pri la diverseco de malrapidaj fibroj preter MYH (Mikrofibra Hipoproteina Haŭta Proteino), ni taksis kvar establitajn proteinojn specifajn por tipoj de malrapidaj fibroj: TPM3, TNNT1, MYL3, kaj ATP2A22. Subtipoj de malrapidaj fibroj montris altajn, kvankam ne perfektajn, Pearson-korelaciojn kun MYH7 en kaj transkriptomiko (Aldona Figuro 5A) kaj proteomiko (Aldona Figuro 5B). Ĉirkaŭ 25% kaj 33% de la malrapidaj fibroj ne estis klasifikitaj kiel puraj malrapidaj fibroj laŭ ĉiuj geno/proteinaj subtipoj en transkriptomiko (Aldona Figuro 5C) kaj proteomiko (Aldona Figuro 5D), respektive. Tial, klasifiko de malrapidaj fibroj bazita sur pluraj geno/proteinaj subtipoj enkondukas plian kompleksecon, eĉ por proteinoj konataj kiel fibrospecifaj. Ĉi tio sugestas, ke klasifiko de fibroj bazita sur izoformoj de ununura geno/proteina familio eble ne adekvate reflektas la veran diversecon de skeletmuskolaj fibroj.
Por plue esplori la fenotipan ŝanĝiĝemon de homaj skeletmuskolaj fibroj je la skalo de la tuta omika modelo, ni efektivigis senantaŭjuĝan dimensiecredukton de la datumoj uzante ĉefkomponantan analizon (PCA) (Figuro 2A). Simile al UMAP-diagramoj, nek la partoprenanto nek la testtago influis fibragregaciigon je la PCA-nivelo (Aldonaj Figuroj 6A-C). En ambaŭ datumaroj, MYH-bazita fibrotipo estis klarigita per PC2, kiu montris areton de malrapid-konvulsiaj tipo 1 fibroj kaj duan areton enhavantan rapid-konvulsiajn tipojn 2A, 2X, kaj miksitajn 2A/2X fibrojn (Figuro 2A). En ambaŭ datumaroj, ĉi tiuj du aretoj estis konektitaj per malgranda nombro da miksitaj tipoj 1/2A fibroj. Kiel atendite, troreprezentanta analizo de la ĉefaj PC-peliloj konfirmis, ke PC2 estis pelita de kuntiriĝaj kaj metabolaj signaturoj (Figuro 2B kaj Aldonaj Figuroj 6D-E, Aldonaj Datumaroj 5-6). Ĝenerale, MYH-bazita fibrotipo montriĝis sufiĉa por klarigi kontinuan variadon laŭ PC2, kun la escepto de tiel nomataj 2X fibroj, kiuj estis distribuitaj tra la transkriptomo ene de la rapida areto.
A. Diagramoj de ĉefkomponanta analizo (PCA) de transkriptomaj kaj proteomaj datumaroj kolorigitaj laŭ fibrotipo bazita sur MYH. B. Riĉiga analizo de transkriptomaj kaj proteinaj peliloj en PC2 kaj PC1. Statistika analizo estis farita uzante la pakaĵon clusterProfiler kaj Benjamini-Hochberg adaptitajn p-valorojn. C, D. PCA-diagramoj kolorigitaj laŭ interĉelaj adhergenaj genaj ontologiaj (GO) terminoj en la transkriptomo kaj kostameraj GO-terminoj en la proteomo. Sagoj reprezentas transkriptomajn kaj proteinajn pelilojn kaj iliajn direktojn. E, F. Trajtodiagramoj de unuforma multnombra aproksimado kaj projekcio (UMAP) de klinike signifaj trajtoj montrantaj esprimgradientojn sendepende de malrapida/rapida fibrotipo. G, H. Korelacioj inter PC2 kaj PC1 peliloj en transkriptomoj kaj proteomoj.
Neatendite, la MYH-bazita miofibra tipo klarigis nur la duan plej altan gradon de ŝanĝiĝemo (PC2), sugestante, ke aliaj biologiaj faktoroj senrilataj al la MYH-bazita miofibra tipo (PC1) ludas gravan rolon en la reguligo de la diverseco de skeletmuskolaj fibroj. Analizo de troreprezentado de la ĉefaj faktoroj en PC1 rivelis, ke ŝanĝiĝemo en PC1 estis ĉefe determinita de ĉel-ĉela adhero kaj ribosoma enhavo en la transkriptomo, kaj kostameroj kaj ribosomaj proteinoj en la proteomo (Figuro 2B kaj Aldonaj Figuroj 6D-E, Aldona Datuma Aro 7). En skeletmuskolo, kostameroj konektas la Z-diskon al la sarkolemo kaj partoprenas en forttransdono kaj signalado. 25 Prinotitaj PCA-diagramoj uzantaj ĉel-ĉelan adheron (transkriptomo, Figuro 2C) kaj kostameroj (proteomo, Figuro 2D) trajtojn rivelis fortan maldekstran ŝoviĝon en PC1, indikante, ke ĉi tiuj trajtoj estas riĉigitaj je certaj fibroj.
Pli detala ekzameno de miofibra agregaciado je la UMAP-nivelo rivelis, ke la plej multaj trajtoj montris miofibran tipo-sendependan MYH-bazitan esprimgradienton anstataŭ miofibran subareto-specifan. Ĉi tiu kontinueco estis observita por pluraj genoj asociitaj kun patologiaj kondiĉoj (Figuro 2E), kiel ekzemple CHCHD10 (neŭromuskola malsano), SLIT3 (muskola atrofio), CTDNEP1 (muskola malsano). Ĉi tiu kontinueco ankaŭ estis observita tra la proteomo, inkluzive de proteinoj asociitaj kun neŭrologiaj malsanoj (UGDH), insulinsignalado (PHIP) kaj transskribo (HIST1H2AB) (Figuro 2F). Kolektive, ĉi tiuj datumoj indikas kontinuecon en fibrotipo-sendependa malrapida/rapida konvulsia heterogeneco trans malsamaj miofibroj.
Interese, pelilaj genoj en PC2 montris bonan korelacion inter transkriptomo kaj proteomo (r = 0.663) (Figuro 2G), sugestante, ke malrapidaj kaj rapid-konvulsiaj fibroj, kaj precipe la kuntiriĝaj kaj metabolaj ecoj de skeletmuskolaj fibroj, estas transskribe reguligitaj. Tamen, pelilaj genoj en PC1 montris neniun korelacion inter transkriptomo kaj proteomo (r = -0.027) (Figuro 2H), sugestante, ke varioj senrilataj al malrapidaj/rapid-konvulsiaj fibroj estas plejparte reguligitaj post-transskribe. Ĉar varioj en PC1 estis ĉefe klarigitaj per ribosomaj genaj ontologiaj terminoj, kaj ĉar ribosomoj ludas decidan kaj specialigitan rolon en la ĉelo per aktive partoprenado en kaj influado de proteintraduko,31 ni poste eklaboris por esplori ĉi tiun neatenditan ribosoman diversecon.
Ni unue kolorigis la proteomikan ĉefkomponentan analizon laŭ la relativa abundeco de proteinoj en la GOCC-termino "citoplasma ribosomo" (Figuro 3A). Kvankam ĉi tiu termino estas riĉigita ĉe la pozitiva flanko de PC1, rezultante en malgranda gradiento, ribosomaj proteinoj pelas dividon en ambaŭ direktoj de PC1 (Figuro 3A). Ribosomaj proteinoj riĉigitaj ĉe la negativa flanko de PC1 inkluzivis RPL18, RPS18, kaj RPS13 (Figuro 3B), dum RPL31, RPL35, kaj RPL38 (Figuro 3C) estis la ĉefaj peliloj ĉe la pozitiva flanko de PC1. Interese, RPL38 kaj RPS13 estis tre esprimitaj en skeletmuskolo kompare kun aliaj histoj (Aldona Figuro 7A). Ĉi tiuj distingaj ribosomaj signaturoj en PC1 ne estis observitaj en la transkriptomo (Aldona Figuro 7B), indikante post-transskriban reguligon.
A. Analizo de ĉefaj komponantoj (PCA) kolorigita laŭ citoplasmaj ribosomaj genaj ontologiaj (GO) terminoj tra la proteomo. Sagoj indikas la direkton de protein-mediaciita vario en la PCA-diagramo. Liniolongo respondas al la ĉefa komponanta poentaro por difinita proteino. B, C. PCA-trajtaj diagramoj por RPS13 kaj RPL38. D. Memstara hierarkia agregacia analizo de citoplasmaj ribosomaj proteinoj. E. Struktura modelo de la 80S ribosomo (PDB: 4V6X) elstariganta ribosomajn proteinojn kun malsamaj abundecoj en skeletmuskolaj fibroj. F. Ribosomaj proteinoj kun malsama stoiĥiometrio lokalizitaj proksime al la mRNA-elira kanalo.
La konceptoj de ribosoma diverseco kaj specialiĝo jam estis proponitaj antaŭe, per kiuj la ĉeesto de apartaj ribosomaj subpopulacioj (ribosoma diverseco) povas rekte influi proteintradukon en malsamaj histoj32 kaj ĉeloj33 per la selektema traduko de specifaj mRNA-transskribaĵaj aroj34 (ribosoma specialiĝo). Por identigi subpopulaciojn de ribosomaj proteinoj kunesprimitaj en skeletmuskolaj fibroj, ni plenumis memstara hierarkia agregacia analizo de ribosomaj proteinoj en la proteomo (Figuro 3D, Suplementa Datumaro 8). Kiel atendite, ribosomaj proteinoj ne grupiĝis laŭ fibrotipo bazita sur MYH. Tamen, ni identigis tri apartajn aretojn de ribosomaj proteinoj; la unua areto (ribosoma_areto_1) estas kunreguligita kun RPL38 kaj tial havas pliigitan esprimon en fibroj kun pozitiva PC1-profilo. La dua areto (ribosoma_areto_2) estas kunreguligita kun RPS13 kaj estas pliigita en fibroj kun negativa PC1-profilo. La tria aro (ribosomal_cluster_3) ne montras kunordigitan diferencigan esprimon en skeletmuskolaj fibroj kaj povas esti konsiderata la "kerna" skeletmuskola ribosomal proteino. Ambaŭ ribosomalaj aretoj 1 kaj 2 enhavas ribosomalajn proteinojn, kiuj antaŭe montriĝis reguligi alternativan tradukadon (ekz., RPL10A, RPL38, RPS19, kaj RPS25) kaj funkcie influi disvolviĝon (ekz., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Kongrue kun la PCA-rezultoj, la observita heterogena reprezentado de ĉi tiuj ribosomalaj proteinoj trans fibroj ankaŭ montris kontinuecon (Aldona Figuro 7C).
Por bildigi la lokon de heterogenaj ribosomaj proteinoj ene de la ribosomo, ni uzis strukturan modelon de la homa 80S-ribosomo (Protein Data Bank: 4V6X) (Figuro 3E). Post izolado de ribosomaj proteinoj apartenantaj al malsamaj ribosomaj aretoj, iliaj lokoj ne estis proksime vicigitaj, sugestante ke nia aliro ne sukcesis provizi riĉigon por certaj regionoj/frakcioj de la ribosomo. Interese, tamen, la proporcio de grandaj subunuaj proteinoj en areto 2 estis pli malalta ol en aretoj 1 kaj 3 (Aldona Figuro 7D). Ni observis, ke proteinoj kun ŝanĝita stoiĥiometrio en skeletmuskolaj fibroj estis ĉefe lokigitaj al la ribosoma surfaco (Figuro 3E), konforme al ilia kapablo interagi kun internaj ribosomaj enirejaj (IRES) elementoj en malsamaj mRNA-populacioj, tiel kunordigante selektivan tradukadon. 40, 41 Krome, multaj proteinoj kun ŝanĝita stoiĥiometrio en skeletmuskolaj fibroj estis lokigitaj proksime al funkciaj regionoj kiel la mRNA-elireja tunelo (Figuro 3F), kiuj selektive reguligas tradukan plilongigon kaj areston de specifaj peptidoj. 42 Resumante, niaj datumoj sugestas, ke la stoiĥiometrio de ribosomaj proteinoj de skeletmuskolo montras diversecon, rezultante en diferencoj inter skeletmuskolfibroj.
Ni poste celis identigi rapid- kaj malrapid-konvulsiajn fibro-signaturojn kaj esplori la mekanismojn de ilia transskriba reguligo. Komparante la rapid- kaj malrapid-konvulsiajn fibrajn aretojn difinitajn de UMAP en la du datumbazoj (Figuroj 1G-H kaj 4A-B), transkriptomaj kaj proteomaj analizoj identigis 1366 kaj 804 diference abundajn trajtojn, respektive (Figuroj 4A-B, Suplementaj Datumbazoj 9-12). Ni observis la atenditajn diferencojn en signaturoj rilataj al sarkomeroj (ekz., tropomiozino kaj troponino), ekscito-kuntiriĝa kuplado (SERCA-izoformoj), kaj energia metabolo (ekz., ALDOA kaj CKB). Krome, transskribaĵoj kaj proteinoj reguligantaj proteinan ubikvitinigon estis diference esprimitaj en rapid- kaj malrapid-konvulsiaj fibroj (ekz., USP54, SH3RF2, USP28, kaj USP48) (Figuroj 4A-B). Krome, la mikroba proteina geno RP11-451G4.2 (DWORF), kiu antaŭe montriĝis esti malsame esprimita trans ŝafidaj muskolfibroj43 kaj plifortigas SERCA-agadon en kormuskolo44, estis signife suprenreguligita en malrapidaj skeletmuskolfibroj (Figuro 4A). Simile, je la individua fibronivelo, signifaj diferencoj estis observitaj en konataj signaturoj kiel metabol-rilataj laktataj dehidrogenazaj izoformoj (LDHA kaj LDHB, Figuro 4C kaj Aldona Figuro 8A)45,46 same kiel antaŭe nekonataj fibro-specifaj signaturoj (kiel IRX3, USP54, USP28, kaj DPYSL3) (Figuro 4C). Estis signifa interkovro de malsame esprimitaj trajtoj inter la transkriptomaj kaj proteomaj datumaroj (Aldona Figuro 8B), same kiel faldŝanĝa korelacio ĉefe pelita de la pli okulfrapa diferenciga esprimo de sarkomeraj trajtoj (Aldona Figuro 8C). Rimarkinde, iuj signaturoj (ekz. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) montris fortan post-transskriban reguligon nur je la proteomika nivelo kaj havis malrapidajn/rapidajn konvulsiajn fibrospecifajn esprimajn profilojn (Aldona Figuro 8C).
Vulkanaj grafikaĵoj A kaj B komparantaj malrapidajn kaj rapidajn aretojn identigitajn per la grafikaĵoj de unuforma multflanka aproksimado kaj projekcio (UMAP) en Figuroj 1G–H. Koloraj punktoj reprezentas transskribaĵojn aŭ proteinojn, kiuj estas signife malsamaj ĉe FDR < 0.05, kaj pli malhelaj punktoj reprezentas transskribaĵojn aŭ proteinojn, kiuj estas signife malsamaj ĉe logaritma ŝanĝo > 1. Dudirekta statistika analizo estis farita uzante la DESeq2 Wald-teston kun Benjamini-Hochberg-adaptitaj p-valoroj (transkriptomiko) aŭ la Limma-linearan modelan metodon kun empiria Bajeza analizo sekvita de Benjamini-Hochberg-adaptiĝo por multoblaj komparoj (proteomiko). C Signaturaj grafikaĵoj de elektitaj diference esprimitaj genoj aŭ proteinoj inter malrapidaj kaj rapidaj fibroj. D Riĉiga analizo de signife diference esprimitaj transskribaĵoj kaj proteinoj. Interkovrantaj valoroj estas riĉigitaj en ambaŭ datumaroj, transskribaĵaj valoroj estas riĉigitaj nur en la transskribaĵa, kaj proteomaj valoroj estas riĉigitaj nur en la proteoma. Statistika analizo estis farita uzante la pakaĵon clusterProfiler kun Benjamini-Hochberg-adaptitaj p-valoroj. E. Fibrospecifaj transkripcifaktoroj identigitaj de SCENIC surbaze de SCENIC-derivitaj reguligaj specifecaj poentaroj kaj diferenciga mRNA-esprimo inter fibrospecoj. F. Profilado de elektitaj transkripcifaktoroj diferencige esprimitaj inter malrapidaj kaj rapidaj fibroj.
Ni poste faris troreprezentan analizon de malsame reprezentitaj genoj kaj proteinoj (Figuro 4D, Aldona Datumaro 13). Riĉigo de la vojoj por trajtoj, kiuj diferencis inter la du datumaroj, rivelis atenditajn diferencojn, kiel ekzemple grasacida β-oksidado kaj ketonmetabolaj procezoj (malrapidaj fibroj), miofilamenta/muskola kuntiriĝo (rapidaj kaj malrapidaj fibroj, respektive), kaj karbonhidrataj katabolaj procezoj (rapidaj fibroj). Serina/treonina proteina fosfataza aktiveco ankaŭ estis pliigita en rapidaj fibroj, pelita de trajtoj kiel la reguligaj kaj katalizaj fosfatazaj subunuoj (PPP3CB, PPP1R3D, kaj PPP1R3A), kiuj estas konataj pro reguligo de glikogena metabolo (47) (Aldonaj Figuroj 8D-E). Aliaj vojoj riĉigitaj per rapidaj fibroj inkluzivis prilaborajn (P-) korpojn (YTHDF3, TRIM21, LSM2) en la proteomo (Aldona Figuro 8F), eble implikitajn en post-transskriba reguligo (48), kaj transkripcifaktoran agadon (SREBF1, RXRG, RORA) en la transkriptomo (Aldona Figuro 8G). Malrapidaj fibroj estis riĉigitaj per oksidoriduktaza agado (BDH1, DCXR, TXN2) (Aldona Figuro 8H), amida ligado (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Aldona Figuro 8I), eksterĉela matrico (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Aldona Figuro 8J), kaj receptor-liganda agado (FNDC5, SPX, NENF) (Aldona Figuro 8K).
Por akiri pliajn komprenojn pri la transkripcia reguligo subestanta la karakterizaĵojn de malrapidaj/rapidaj muskolfibroj, ni faris analizon de riĉigo de transkripciaj faktoroj uzante SCENIC49 (Aldona Datumaro 14). Multaj transkripciaj faktoroj estis signife riĉigitaj inter rapidaj kaj malrapidaj muskolfibroj (Figuro 4E). Tio inkluzivis transkripciajn faktorojn kiel MAFA, kiu antaŭe estis ligita al rapida muskolfibra disvolviĝo,50 same kiel plurajn transkripciajn faktorojn ne antaŭe asociitajn kun genprogramoj specifaj por muskolfibroj. Inter ĉi tiuj, PITX1, EGR1, kaj MYF6 estis la plej riĉigitaj transkripciaj faktoroj en rapidaj muskolfibroj (Figuro 4E). Kontraste, ZSCAN30 kaj EPAS1 (ankaŭ konata kiel HIF2A) estis la plej riĉigitaj transkripciaj faktoroj en malrapidaj muskolfibroj (Figuro 4E). Konforme al tio, MAFA estis esprimita je pli altaj niveloj en la UMAP-regiono korespondanta al rapidaj muskolfibroj, dum EPAS1 havis la kontraŭan esprimpadronon (Figuro 4F).
Aldone al konataj protein-kodantaj genoj, ekzistas multaj ne-kodantaj RNA-biotipoj, kiuj povus esti implikitaj en la reguligo de homa disvolviĝo kaj malsano. 51, 52 En transkriptomaj datumaroj, pluraj ne-kodantaj RNA-oj montras specifiecon por fibrotipo (Figuro 5A kaj Suplementa Datumaro 15), inkluzive de LINC01405, kiu estas tre specifa por malrapidaj fibroj kaj laŭdire estas malpliigita en muskolo de pacientoj kun mitokondria miopatio. 53 Kontraste, RP11-255P5.3, korespondanta al la geno lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, montras specifiecon por rapidaj fibrotipoj. Kaj LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) kaj RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) montras skeletmuskolan specifecon (Aldonaj Figuroj 9A-B) kaj ne havas konatajn kuntirivajn genojn ene de sia 1 Mb genomika najbareco, sugestante, ke ili ludas specialigitan rolon en reguligo de fibrospecoj anstataŭ reguligo de najbaraj kuntiriĝaj genoj. La malrapidaj/rapidaj fibrospecifaj esprimaj profiloj de LINC01405 kaj RP11-255P5.3, respektive, estis konfirmitaj uzante RNAscope (Figuroj 5B-C).
A. Ne-ĉifrantaj RNA-transskribaĵoj estas signife reguligitaj en malrapid- kaj rapid-konvulsiaj muskolfibroj. B. Reprezentaj RNAscope-bildoj montrantaj la malrapid- kaj rapid-konvulsiajn fibrospecifecon de LINC01405 kaj RP11-255P5.3, respektive. Skalbreto = 50 μm. C. Kvantigo de miofibro-tipo-specifa ne-ĉifranta RNA-esprimo kiel determinite per RNAscope (n = 3 biopsioj de sendependaj individuoj, komparante rapidajn kaj malrapidajn muskolfibrojn ene de ĉiu individuo). Statistika analizo estis farita uzante duvostan t-teston de Student. Skatolaj diagramoj montras la medianon kaj la unuan kaj trian kvartilojn, kun lipharoj montrantaj al la minimumaj kaj maksimumaj valoroj. D. De novo mikroba proteina identiglaboro (kreita per BioRender.com). E. La mikroba proteino LINC01405_ORF408:17441:17358 estas specife esprimita en malrapidaj skeletmuskolfibroj (n = 5 biopsioj de sendependaj partoprenantoj, komparante rapidajn kaj malrapidajn muskolfibrojn en ĉiu partoprenanto). Statistika analizo estis farita uzante la metodon de la lineara modelo de Limm kombinitan kun empiria Bajeza aliro, sekvata de la metodo de Benjamini-Hochberg por multoblaj komparoj kun p-valora alĝustigo. Skatoldiagramoj montras la medianon, unuan kaj trian kvartilojn, kun lipharoj montrantaj al la maksimumaj/minimumaj valoroj.
Lastatempe, studoj montris, ke multaj supozeblaj ne-kodantaj transskribaĵoj ĉifras transskribitajn mikrobajn proteinojn, el kiuj kelkaj reguligas muskolan funkcion. 44, 55 Por identigi mikrobajn proteinojn kun ebla specifeco por fibrotipoj, ni serĉis nian datumbazon de 1000 fibraj proteomoj uzante kutiman FASTA-dosieron enhavantan la sekvencojn de ne-kodantaj transskribaĵoj (n = 305) trovitajn en la datumbazo de 1000 fibraj transskribaĵoj (Figuro 5D). Ni identigis 197 mikrobajn proteinojn el 22 malsamaj transskribaĵoj, el kiuj 71 estis malsame reguligitaj inter malrapidaj kaj rapidaj skeletmuskolaj fibroj (Aldona Figuro 9C kaj Aldona Datenbazo 16). Por LINC01405, tri mikrobaj proteinaj produktoj estis identigitaj, unu el kiuj montris similan specifecon por malrapidaj fibroj al sia transskribaĵo (Figuro 5E kaj Aldona Figuro 9D). Tiel, ni identigis LINC01405 kiel genon kodantan mikroban proteinon specifan por malrapidaj skeletmuskolaj fibroj.
Ni evoluigis ampleksan laborfluon por grandskala proteomika karakterizado de individuaj muskolfibroj kaj identigis regulilojn de fibrodiverseco en sanaj statoj. Ni aplikis ĉi tiun laborfluon por kompreni kiel nemalinaj miopatioj influas la diversecon de skeletmuskolfibroj. Nemalinaj miopatioj estas hereditaj muskolaj malsanoj, kiuj kaŭzas muskolan malfortecon kaj, ĉe trafitaj infanoj, prezentiĝas kun gamo da komplikaĵoj, inkluzive de spira aflikto, skoliozo kaj limigita membra movebleco. 19,20 Tipe, en nemalinaj miopatioj, patogenaj variaĵoj en genoj kiel aktino alfao 1 (ACTA1) rezultas en superrego de malrapid-konvulsia fibromiofibra konsisto, kvankam ĉi tiu efiko estas heterogena. Unu rimarkinda escepto estas troponina T1 nemalina miopatio (TNNT1), kiu havas superregon de rapidaj fibroj. Tiel, pli bona kompreno pri la diverseco subestanta la skeletmuskolfibrojn misreguligitajn observitajn en nemalinaj miopatioj povus helpi malimpliki la kompleksan rilaton inter ĉi tiuj malsanoj kaj miofibra tipo.
Kompare kun sanaj kontroloj (n=3 por grupo), miofibroj izolitaj de pacientoj kun nemalina miopatio kaj mutacioj en la genoj ACTA1 kaj TNNT1 montris markitan miofibran atrofion aŭ distrofion (Figuro 6A, Aldona Tabelo 3). Ĉi tio prezentis signifajn teknikajn defiojn por proteomika analizo pro la limigita kvanto de havebla materialo. Malgraŭ tio, ni povis detekti 2485 proteinojn en 272 skeletaj miofibroj. Post filtrado por almenaŭ 1000 kvantigitaj proteinoj por fibro, 250 fibroj estis submetitaj al posta bioinformadika analizo. Post filtrado, averaĝe 1573 ± 359 proteinoj por fibro estis kvantigitaj (Aldona Figuro 10A, Aldonaj Datenoj 17-18). Rimarkinde, malgraŭ la signifa redukto de fibrograndeco, la proteoma profundo de pacientaj specimenoj kun nemalina miopatio estis nur modeste reduktita. Krome, la prilaborado de ĉi tiuj datumoj per niaj propraj FASTA-dosieroj (inkluzive de ne-kodantaj transskribaĵoj) permesis al ni identigi kvin mikrobajn proteinojn en skeletmiofibroj de pacientoj kun nemalina miopatio (Aldona Datumaro 19). La dinamika gamo de la proteomo estis signife pli larĝa, kaj la totalaj proteinoj en la kontrolgrupo bone korelaciis kun la rezultoj de antaŭa 1000-fibra proteoma analizo (Aldona Figuro 10B-C).
A. Mikroskopaj bildoj montrantaj fibratrofion aŭ distrofion kaj la superregon de malsamaj fibrotipoj bazitaj sur MYH en ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj (NM). Skalo = 100 μm. Por certigi reprodukteblecon de tinkturado en ACTA1 kaj TNNT1 pacientoj, tri pacientaj biopsioj estis tinkturitaj du ĝis tri fojojn (kvar sekcioj por kazo) antaŭ ol selekti reprezentajn bildojn. B. Proporcioj de fibrotipoj ĉe partoprenantoj bazitaj sur MYH. C. Analizo de ĉefaj komponantoj (PCA) de skeletmuskolfibroj en pacientoj kun nemalinaj miopatioj kaj kontroloj. D. Skeletmuskolfibroj de pacientoj kun nemalinaj miopatioj kaj kontroloj projekciitaj sur PCA-intrigo determinita el la 1000 fibroj analizitaj en Figuro 2. Ekzemple, vulkano-intrigo komparantaj diferencojn inter partoprenantoj kun ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj kaj kontroloj, kaj inter partoprenantoj kun ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj. Koloraj cirkloj indikas proteinojn, kiuj estis signife malsamaj ĉe π < 0.05, kaj malhelaj punktoj indikas proteinojn, kiuj estis signife malsamaj ĉe FDR < 0.05. Statistika analizo estis farita uzante la Limma-linearan modelan metodon kaj empiriajn Bajesajn metodojn, sekvata de p-valora alĝustigo por multoblaj komparoj uzante la Benjamini-Hochberg-metodon. H. Riĉiga analizo de signife diference esprimitaj proteinoj tra la tuta proteomo kaj en tipo 1 kaj 2A fibroj. Statistika analizo estis farita uzante la pakaĵon clusterProfiler kaj Benjamini-Hochberg-alĝustigitajn p-valorojn. I, J. Ĉefaj komponantaj analizoj (PCA) kolorigitaj laŭ eksterĉela matrico kaj mitokondriaj genaj ontologiaj (GO) terminoj.
Ĉar nemalinaj miopatioj povas influi la proporcion de MYH-esprimantaj miofibraj tipoj en skeletmuskolo,19,20 ni unue ekzamenis la MYH-esprimantajn miofibrajn tipojn en pacientoj kun nemalinaj miopatioj kaj kontroloj. Ni determinis la miofibran tipon uzante senantaŭjuĝan metodon antaŭe priskribitan por la analizo de 1000 miofibraj (Aldonaj Figuroj 10D-E) kaj denove malsukcesis identigi purajn 2X miofibrojn (Figuro 6B). Ni observis heterogenan efikon de nemalinaj miopatioj sur la miofibra tipo, ĉar du pacientoj kun ACTA1-mutacioj havis pliigitan proporcion de tipo 1 miofibroj, dum du pacientoj kun TNNT1-nemalina miopatio havis malpliigitan proporcion de tipo 1 miofibroj (Figuro 6B). Efektive, la esprimo de MYH2 kaj rapidaj troponin-izoformoj (TNNC2, TNNI2, kaj TNNT3) estis malpliigita en ACTA1-nemalinaj miopatioj, dum la esprimo de MYH7 estis malpliigita en TNNT1-nemalinaj miopatioj (Aldona Figuro 11A). Ĉi tio kongruas kun antaŭaj raportoj pri ŝanĝo de heterogena miofibra tipo en nemalinaj miopatioj.19,20 Ni konfirmis ĉi tiujn rezultojn per imunohistokemio kaj trovis, ke pacientoj kun ACTA1-nemalina miopatio havis superregon de tipo 1 miofibroj, dum pacientoj kun TNNT1-nemalina miopatio havis la kontraŭan padronon (Figuro 6A).
Je la nivelo de unu-fibra proteomo, skeletmuskolaj fibroj de pacientoj kun ACTA1 kaj TNNT1 nemalina miopatio grupiĝis kun la plimulto de kontrolfibroj, kun TNNT1 nemalina miopatiaj fibroj ĝenerale estantaj la plej grave trafitaj (Figuro 6C). Ĉi tio estis precipe evidenta dum desegnado de ĉefkomponanta analizo (PCA) de pseŭdo-ŝvelintaj fibroj por ĉiu paciento, kun TNNT1 nemalina miopatiaj pacientoj 2 kaj 3 aperantaj la plej malproksimaj de kontrolspecimenoj (Aldona Figuro 11B, Aldona Datenaro 20). Por pli bone kompreni kiel fibroj de miopatiaj pacientoj komparas kun sanaj fibroj, ni uzis detalajn informojn akiritajn de proteomika analizo de 1,000 fibroj de sanaj plenkreskaj partoprenantoj. Ni projekciis fibrojn de la miopatia datumbazo (ACTA1 kaj TNNT1 nemalina miopatio-pacientoj kaj kontroloj) sur la PCA-diagramon akiritan de la 1000-fibra proteomika analizo (Figuro 6D). La distribuo de MYH-fibro-tipoj laŭlonge de PC2 en kontrolfibroj estis simila al la fibro-distribuo akirita per la 1000-fibra proteomika analizo. Tamen, la plej multaj fibroj en pacientoj kun nemalina miopatio ŝoviĝis laŭ PC2, interkovriĝante kun sanaj rapid-konvulsiaj fibroj, sendepende de ilia denaska MYH-fibro-tipo. Tiel, kvankam pacientoj kun ACTA1-nemalina miopatio montris ŝoviĝon al tipo 1-fibroj kiam kvantigitaj per MYH-bazitaj metodoj, kaj ACTA1-nemalina miopatio kaj TNNT1-nemalina miopatio ŝovigis la skeletmuskolfibran proteomon direkte al rapid-konvulsiaj fibroj.
Ni poste rekte komparis ĉiun pacientan grupon kun sanaj kontroloj kaj identigis 256 kaj 552 diference esprimitajn proteinojn en ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj, respektive (Figuro 6E–G kaj Suplementa Figuro 11C, Suplementa Datumaro 21). Analizo de genriĉigo rivelis kunordigitan malpliiĝon de mitokondriaj proteinoj (Figuro 6H–I, Suplementa Datumaro 22). Surprize, malgraŭ la diferenciga superrego de fibrotipoj en ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj, ĉi tiu malpliiĝo estis tute sendependa de la MYH-bazita fibrotipo (Figuro 6H kaj Suplementaj Figuroj 11D–I, Suplementa Datumaro 23). Tri mikrobaj proteinoj ankaŭ estis reguligitaj en ACTA1 aŭ TNNT1 nemalinaj miopatioj. Du el ĉi tiuj mikroproteinoj, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ankaŭ konata kiel LINC00598 aŭ Lnc-FOXO1) kaj ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), montris diferencigan abundon nur en tipo 1 miofibroj. Antaŭe oni raportis, ke ENSG00000215483_TR14_ORF67 ludas rolon en la reguligo de ĉelciklo. 56 Aliflanke, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (korespondanta al LINC01798) estis pliigita en kaj tipo 1 kaj tipo 2A miofibroj en ACTA1-nemalina miopatio kompare kun sanaj kontroloj (Aldona Figuro 12A, Aldona Datumaro 24). Kontraste, ribosomalaj proteinoj estis plejparte netuŝitaj de nemalina miopatio, kvankam RPS17 estis malsuprenreguligita en ACTA1-nemalina miopatio (Fig. 6E).
Riĉiga analizo ankaŭ rivelis pliigon de imunsistemaj procezoj en ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj, dum ĉela adhero ankaŭ pliiĝis en TNNT1 nemalina miopatio (Figuro 6H). La riĉigo de ĉi tiuj eksterĉelaj faktoroj estis reflektita per la eksterĉelaj matricaj proteinoj ŝovantaj PCA en PC1 kaj PC2 en negativa direkto (t.e., direkte al la plej trafitaj fibroj) (Figuro 6J). Ambaŭ pacientaj grupoj montris pliigitan esprimon de eksterĉelaj proteinoj implikitaj en imunaj respondoj kaj sarkolemaj riparmekanismoj, kiel ekzemple aneksinoj (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 kaj ilia interaganta proteino S100A1159 (Aldonaj Figuroj 12B-C). Ĉi tiu procezo estis antaŭe raportita kiel plifortigita en muskolaj distrofioj60 sed, laŭ nia scio, ĝi ne estis antaŭe asociita kun nemalinaj miopatioj. Normala funkcio de ĉi tiu molekula maŝinaro estas necesa por sarkolema riparo post vundo kaj por la fuzio de nove formitaj miocitoj kun miofibroj58,61. Tiel, la pliigita aktiveco de ĉi tiu procezo en ambaŭ pacientogrupoj sugestas riparan respondon al vundo kaŭzita de miofibra malstabileco.
La efikoj de ĉiu nemalina miopatio estis bone korelaciitaj (r = 0.736) kaj montris akcepteblan interkovron (Aldonaj Figuroj 11A-B), indikante ke ACTA1 kaj TNNT1 nemalina miopatio havas similajn efikojn sur la proteomo. Tamen, iuj proteinoj estis reguligitaj nur en ACTA1- aŭ TNNT1 nemalina miopatio (Aldonaj Figuroj 11A kaj C). La profibroza proteino MFAP4 estis unu el la plej suprenreguligitaj proteinoj en TNNT1 nemalina miopatio sed restis senŝanĝa en ACTA1 nemalina miopatio. SKIC8, komponanto de la PAF1C-komplekso respondeca pri reguligo de la HOX-gena transskribo, estis malsuprenreguligita en TNNT1 nemalina miopatio sed ne trafita en ACTA1 nemalina miopatio (Aldona Figuro 11A). Rekta komparo de ACTA1 kaj TNNT1 nemalina miopatio rivelis pli grandajn reduktojn en mitokondriaj proteinoj kaj pliiĝojn en imunsistemaj proteinoj en TNNT1 nemalina miopatio (Figuro 6G–H kaj Suplementaj Figuroj 11C kaj 11H–I). Ĉi tiuj datumoj kongruas kun la pli granda atrofio/distrofio observita en TNNT1 nemalina miopatio kompare kun TNNT1 nemalina miopatio (Figuro 6A), sugestante ke TNNT1 nemalina miopatio reprezentas pli severan formon de la malsano.
Por taksi ĉu la observitaj efikoj de nemalina miopatio daŭras je la tuta muskola nivelo, ni faris amasproteomikan analizon de muskolaj biopsioj de la sama kohorto de TNNT1-nemalina miopatiaj pacientoj kaj komparis ilin kun kontroloj (n=3 por grupo) (Aldona Figuro 13A, Aldona Datumaro 25). Kiel atendite, la kontroloj estis proksime parencaj en ĉefkomponanta analizo, dum TNNT1-nemalina miopatiaj pacientoj montris pli altan interprovaĵan ŝanĝeblecon similan al tiu vidita en unuopa fibra analizo (Aldona Figuro 13B). Amasanalizo reproduktis la diference esprimitajn proteinojn (Aldona Figuro 13C, Aldona Datumaro 26) kaj biologiajn procezojn (Aldona Figuro 13D, Aldona Datumaro 27) elstarigitajn per komparado de individuaj fibroj, sed perdis la kapablon distingi inter malsamaj fibrotipoj kaj ne sukcesis konsideri heterogenajn malsanefikojn trans fibroj.
Sume, ĉi tiuj datumoj montras, ke unu-miofibra proteomiko povas pliklarigi klinikajn biologiajn trajtojn, kiuj ne estas detekteblaj per celitaj metodoj kiel imunoblotado. Krome, ĉi tiuj datumoj elstarigas la limigojn de uzado de aktina fibro-tipigo (MYH) sole por priskribi fenotipan adaptiĝon. Efektive, kvankam ŝanĝo de fibro-tipo malsamas inter aktinaj kaj troponinaj nemalinaj miopatioj, ambaŭ nemalinaj miopatioj malkuplas MYH-fibro-tipigon de skeletmuskolfibra metabolo direkte al pli rapida kaj malpli oksidativa muskola proteomo.
Ĉela diverseco estas kritika por ke histoj plenumu siajn diversajn bezonojn. En skeletmuskolo, ĉi tio ofte estas priskribita kiel fibrotipoj karakterizitaj per malsamaj gradoj de fortproduktado kaj laceblo. Tamen, estas klare, ke ĉi tio klarigas nur malgrandan parton de la ŝanĝiĝemo de skeletmuskolfibroj, kiu estas multe pli varia, kompleksa kaj multfaceta ol antaŭe pensis. Teknologiaj progresoj nun lumigis la faktorojn, kiuj reguligas skeletmuskolfibrojn. Efektive, niaj datumoj sugestas, ke tipo 2X fibroj eble ne estas aparta subtipo de skeletmuskolfibroj. Krome, ni identigis metabolajn proteinojn, ribosomajn proteinojn kaj ĉel-asociitajn proteinojn kiel ĉefajn determinantojn de diverseco de skeletmuskolfibroj. Aplikante nian proteomikan laborfluon al pacientaj specimenoj kun nematoda miopatio, ni plue montris, ke MYH-bazita fibrotipado ne plene reflektas skeletmuskolan diversecon, precipe kiam la sistemo estas perturbita. Efektive, sendepende de la MYH-bazita fibrotipo, nematoda miopatio rezultas en ŝanĝo al pli rapidaj kaj malpli oksidativaj fibroj.
Skeletmuskolaj fibroj estas klasifikitaj ekde la 19-a jarcento. Lastatempaj omikaj analizoj permesis al ni komenci kompreni la esprimajn profilojn de malsamaj MYH-fibrospecoj kaj iliajn respondojn al malsamaj stimuloj. Kiel priskribite ĉi tie, omikaj aliroj ankaŭ havas la avantaĝon de pli granda sentemo por kvantigi fibrotipajn markilojn ol tradiciaj antikorp-bazitaj metodoj, sen dependi de la kvantigo de unu (aŭ kelkaj) markiloj por difini skeletmuskolajn fibrospecojn. Ni uzis komplementajn transkriptomikajn kaj proteomikajn laborfluojn kaj integris la rezultojn por ekzameni la transskriban kaj post-transskriban reguligon de fibrodiverseco en homaj skeletmuskolaj fibroj. Ĉi tiu laborfluo rezultigis la malsukceson identigi purajn 2X-tipajn fibrojn je la proteina nivelo en la vastus lateralis de nia kohorto de sanaj junaj viroj. Ĉi tio kongruas kun antaŭaj studoj pri unuopaj fibroj, kiuj trovis <1% purajn 2X-fibrojn en sana vastus lateralis, kvankam ĉi tio devus esti konfirmita en aliaj muskoloj en la estonteco. La diferenco inter la detekto de preskaŭ puraj 2X-fibroj je la mRNA-nivelo kaj nur miksitaj 2A/2X-fibroj je la proteina nivelo estas enigma. La esprimo de la mRNA de la izoformo MYH ne estas cirkadia,67 sugestante, ke ni verŝajne ne "maltrafis" la komencsignalon de MYH2 en ŝajne puraj 2X fibroj je la RNA-nivelo. Unu ebla klarigo, kvankam pure hipoteza, povus esti diferencoj en proteina kaj/aŭ mRNA-stabileco inter MYH-izoformoj. Efektive, neniu rapida fibro estas 100% pura por iu ajn MYH-izoformo, kaj ne estas klare, ĉu niveloj de esprimo de MYH1 mRNA en la intervalo de 70-90% rezultus en egala abundo de MYH1 kaj MYH2 je la proteina nivelo. Tamen, konsiderante la tutan transkriptomon aŭ proteomon, areta analizo povas memfide identigi nur du apartajn aretojn reprezentantajn malrapidajn kaj rapidajn skeletmuskolajn fibrojn, sendepende de ilia preciza MYH-konsisto. Ĉi tio kongruas kun analizoj uzantaj unu-nukleajn transkriptomajn alirojn, kiuj tipe identigas nur du apartajn mionukleajn aretojn. 68, 69, 70 Plue, kvankam antaŭaj proteomikaj studoj identigis fibrojn de tipo 2X, ĉi tiuj fibroj ne grupiĝas aparte de la ceteraj rapidaj fibroj kaj montras nur malgrandan nombron da malsame abundaj proteinoj kompare kun aliaj fibrotipoj bazitaj sur MYH. 14 Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke ni revenu al la frua 20-a-jarcenta vidpunkto pri la klasifiko de muskolfibroj, kiu dividis homajn skeletmuskolfibrojn ne en tri apartajn klasojn bazitajn sur MYH, sed en du grupojn bazitajn sur iliaj metabolaj kaj kuntiriĝaj ecoj. 63
Pli grave, la diverseco de miofibraj devus esti konsiderata laŭ pluraj dimensioj. Antaŭaj "omikaj" studoj montris en ĉi tiu direkto, sugestante, ke skeletmuskolaj fibroj ne formas apartajn aretojn sed estas aranĝitaj laŭ kontinuo. 11, 13, 14, 64, 71 Ĉi tie, ni montras, ke, aldone al diferencoj en kuntiriĝaj kaj metabolaj ecoj de skeletmuskolo, miofibroj povas esti diferencigitaj per trajtoj rilataj al ĉel-ĉelaj interagoj kaj tradukaj mekanismoj. Efektive, ni trovis ribosomdiversecon en skeletmuskolaj fibroj, kiu kontribuas al diverseco sendepende de malrapidaj kaj rapidaj fibrotipoj. La subesta kaŭzo de ĉi tiu konsiderinda miofibra diverseco, sendepende de malrapida kaj rapida fibrotipoj, restas neklara, sed ĝi povas indiki specialigitan spacan organizadon ene de muskolaj fascikloj, kiuj optimume respondas al specifaj fortoj kaj ŝarĝoj,72 specialigitan ĉelan aŭ organ-specifan komunikadon kun aliaj ĉeltipoj en la muskola mikromedio73,74,75 aŭ diferencojn en ribosomaktiveco ene de individuaj miofibroj. Efektive, ribosoma heteroplasmio, ĉu per paraloga anstataŭigo de RPL3 kaj RPL3L aŭ je la nivelo de 2'O-metiligo de rRNA, montriĝis asociita kun skeletmuskola hipertrofio76,77. Mult-omaj kaj spacaj aplikoj kombinitaj kun funkcia karakterizado de individuaj miofibroj plu antaŭenigos nian komprenon pri muskola biologio je la mult-oma nivelo78.
Analizante la proteomojn de unuopaj miofibroj de pacientoj kun nemalinaj miopatioj, ni ankaŭ montris la utilecon, efikecon kaj aplikeblecon de unuopaj miofibraj proteomikoj por pliklarigi la klinikan patofiziologion de skeletmuskolo. Krome, komparante nian laborfluon kun tutmonda proteomika analizo, ni povis montri, ke unuopaj miofibraj proteomikoj donas la saman profundon de informoj kiel tutmonda hista proteomiko kaj etendas ĉi tiun profundon per konsiderado de interfibra diverseco kaj miofibra tipo. Aldone al la atenditaj (kvankam variaj) diferencoj en la proporcio de fibrotipoj observitaj en ACTA1 kaj TNNT1 nemalinaj miopatioj kompare kun sanaj kontroloj,19 ni ankaŭ observis oksidativan kaj eksterĉelan remodelado sendepende de MYH-mediaciita ŝanĝo de fibrotipoj. Fibrozo antaŭe estis raportita en TNNT1-nemalinaj miopatioj.19 Tamen, nia analizo konstruas sur ĉi tiu trovo ankaŭ rivelante pliigitajn nivelojn de eksterĉelaj sekreciitaj stres-rilataj proteinoj, kiel ekzemple aneksinoj, implikitaj en sarkolemaj riparmekanismoj, en miofibroj de pacientoj kun ACTA1 kaj TNNT1-nemalinaj miopatioj.57,58,59 Konklude, pliigitaj aneksinaj niveloj en miofibroj de pacientoj kun nemalina miopatio povas reprezenti ĉelan respondon por ripari grave atrofiajn miofibrojn.
Kvankam ĉi tiu studo reprezentas la plej grandan unu-fibran tut-muskola-omikan analizon de homoj ĝis nun, ĝi ne estas sen limigoj. Ni izolis skeletmuskolfibrojn de relative malgranda kaj homogena specimeno de partoprenantoj kaj ununura muskolo (la vastus lateralis). Tial, estas neeble ekskludi la ekziston de specifaj fibraj populacioj tra muskoltipoj kaj ĉe ekstremoj de muskola fiziologio. Ekzemple, ni ne povas ekskludi la eblecon de subaro de ultrarapidaj fibroj (ekz., puraj 2X fibroj) aperantaj en altkvalifikitaj sprintuloj kaj/aŭ fortatletoj79 aŭ dum periodoj de muskola neaktiveco66,80. Krome, la limigita specimenaro de partoprenantoj malhelpis nin esplori seksdiferencojn en fibrodiverseco, ĉar oni scias, ke la proporcioj de fibrotipoj diferencas inter viroj kaj virinoj. Krome, ni ne povis fari transkriptomikajn kaj proteomikajn analizojn sur la samaj muskolfibroj aŭ specimenoj de la samaj partoprenantoj. Dum ni kaj aliaj daŭre optimumigas unuĉelajn kaj unumiofibrajn analizojn uzante omikan analizon por atingi ultramalaltan provaĵan enigaĵon (kiel montrite ĉi tie en la analizo de fibroj de pacientoj kun mitokondria miopatio), la ŝanco kombini multi-omikajn (kaj funkciajn) alirojn ene de unuopaj muskolfibroj fariĝas evidenta.
Ĝenerale, niaj datumoj identigas kaj klarigas transskribajn kaj post-transskribajn faktorojn de skeletmuskola diverseco. Specife, ni prezentas datumojn, kiuj defias delongan dogmon en skeletmuskola fiziologio asociita kun la klasika MYH-bazita difino de fibrotipoj. Ni esperas renovigi la debaton kaj finfine repripensi nian komprenon pri klasifiko kaj diverseco de skeletmuskolaj fibroj.
Dek kvar kaŭkazaj partoprenantoj (12 viroj kaj 2 virinoj) libervole konsentis partopreni en ĉi tiu studo. La studo estis aprobita de la Etika Komitato de la Universitata Hospitalo de Gento (BC-10237), konformis al la Helsinka Deklaro de 2013, kaj estis registrita ĉe ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Ĝeneralaj karakterizaĵoj de la partoprenantoj estas prezentitaj en Aldona Tabelo 1. Post akiro de vorta kaj skriba informita konsento, la partoprenantoj spertis medicinan ekzamenon antaŭ fina inkludo en la studo. La partoprenantoj estis junaj (22-42 jaroj), sanaj (neniuj malsanoj, neniu fumada historio), kaj modere fizike aktivaj. Maksimuma oksigena konsumado estis determinita uzante paŝoergometron por taksi fizikan taŭgecon kiel antaŭe priskribite. 81
Specimenoj de muskola biopsio estis kolektitaj ripoze kaj faste tri fojojn, kun 14 tagoj da diferenco. Ĉar ĉi tiuj specimenoj estis kolektitaj kiel parto de pli granda studo, partoprenantoj konsumis placebon (laktozon), H1-receptoran antagoniston (540 mg feksofenadino), aŭ H2-receptoran antagoniston (40 mg famotidino) 40 minutojn antaŭ la biopsio. Ni antaŭe montris, ke ĉi tiuj histaminaj receptoraj antagonistoj ne influas ripozan skeletmuskolan taŭgecon81, kaj neniu stat-rilata agregaciado estis observita en niaj kvalitkontrolaj grafikaĵoj (Aldonaj Figuroj 3 kaj 6). Normigita dieto (41.4 kcal/kg korpopezo, 5.1 g/kg korpopezo karbonhidrato, 1.4 g/kg korpopezo proteino, kaj 1.6 g/kg korpopezo graso) estis konservita dum 48 horoj antaŭ ĉiu eksperimenta tago, kaj normigita matenmanĝo (1.5 g/kg korpopezo karbonhidrato) estis konsumita matene de la eksperimenta tago. Sub loka anestezo (0,5 ml 1% lidokaino sen adrenalino), muskolaj biopsioj estis akiritaj de la vastus lateralis-muskolo uzante perkutanan Bergström-aspiradon.82 Muskolaj specimenoj estis tuj enmetitaj en RNAlater kaj konservitaj je 4 °C ĝis mana fibrodissekcado (ĝis 3 tagoj).
Ĵus izolitaj miofibraj faskoj estis translokigitaj al freŝa RNAlater-medio en kulturplado. Individuaj miofibroj estis poste mane dissekcitaj per stereomikroskopo kaj fajnaj pinĉiloj. Dudek kvin fibroj estis dissekcitaj el ĉiu biopsio, atentante aparte la elekton de fibroj el malsamaj areoj de la biopsio. Post la dissekcado, ĉiu fibro estis milde mergita en 3 μl da liza bufro (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) enhavanta proteinazon K kaj DNazajn enzimojn por forigi nedeziratajn proteinojn kaj DNA-on. Ĉellizo kaj proteino/DNA-forigo estis poste iniciatitaj per mallonga kirlado, turnado de la likvaĵo en mikrocentrifugilo, kaj inkubacio je ĉambra temperaturo (10 minutoj). La lizato estis poste inkubata en termociklilo (T100, Bio-Rad) je 37°C dum 5 minutoj, 75°C dum 5 minutoj, kaj poste tuj stokita je -80°C ĝis plia prilaborado.
Illumina-kongruaj poliadenilitaj RNA-bibliotekoj estis preparitaj el 2 µl da miofibra lizato uzante la QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detalaj metodoj troveblas en la manlibro de la fabrikanto. La procezo komenciĝas per unua-fadena cDNA-sintezo per inversa transskribo, dum kiu unikaj molekulaj identigiloj (UMI-oj) kaj specimen-specifaj i1-strekkodoj estas enkondukitaj por certigi la kunigadon de specimenoj kaj redukti teknikan ŝanĝiĝemon dum posta prilaborado. cDNA el 96 miofibroj estas tiam kunigita kaj purigita per magnetaj globetoj, post kio RNA estas forigita kaj dua-fadena sintezo estas plenumita uzante hazardajn komencilojn. La biblioteko estas purigita per magnetaj globetoj, kunig-specifaj i5/i7-etikedoj estas aldonitaj, kaj PCR amplifikita. Fina puriga paŝo produktas Illumina-kongruajn bibliotekojn. La kvalito de ĉiu biblioteka kunigo estis taksita uzante la High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Surbaze de Kvbita kvantigo, la aroj estis plue kunigitaj je ekvimolaraj koncentriĝoj (2 nM). La rezulta aro estis poste sekvencita per NovaSeq 6000-instrumento en norma reĝimo uzante la NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotidoj) kun 2 nM ŝarĝo (4% PhiX).
Nia procezo baziĝas sur la datumanaliza procezo QuantSeq Pool de Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Datumoj unue estis demultipleksitaj per bcl2fastq2 (v2.20.0) surbaze de la i7/i5 indekso. Legado 2 estis poste demultipleksita per idemux (v0.1.6) surbaze de la i1-specimena strekkodo kaj UMI-sekvencoj estis ekstraktitaj per umi_tools (v1.0.1). Legaĵoj estis poste pritonditaj per cutadapt (v3.4) en pluraj rondoj por forigi mallongajn legaĵojn (<20 longajn) aŭ legaĵojn konsistantajn nur el adaptilaj sekvencoj. Legaĵoj estis poste vicigitaj al la homa genaro uzante STAR (v2.6.0c) kaj BAM-dosieroj estis indeksitaj per SAMtools (v1.11). Duplikataj legaĵoj estis forigitaj uzante umi_tools (v1.0.1). Fine, viciga nombrado estis farita uzante featureCounts en Subread (v2.0.3). Kvalitkontrolo estis efektivigita uzante FastQC (v0.11.9) ĉe pluraj interaj stadioj de la procezo.
Ĉiuj pliaj bioinformadikaj prilaboradoj kaj bildigoj estis faritaj en R (v4.2.3), ĉefe uzante la laborfluon Seurat (v4.4.0).83 Tial, individuaj UMI-valoroj kaj metadatenaj matricoj estis transformitaj en Seurat-objektojn. Genoj esprimitaj en malpli ol 30% de ĉiuj fibroj estis forigitaj. Malaltkvalitaj specimenoj estis forigitaj surbaze de minimuma sojlo de 1000 UMI-valoroj kaj 1000 detektitaj genoj. Fine, 925 fibroj pasis ĉiujn filtrajn paŝojn de kvalito-kontrolo. UMI-valoroj estis normaligitaj uzante la metodon Seurat SCTransform v2,84 inkluzive de ĉiuj 7418 detektitaj trajtoj, kaj diferencoj inter partoprenantoj estis regresitaj. Ĉiuj koncernaj metadatenoj troveblas en la Aldona Datumaro 28.
Afiŝtempo: 10 septembro 2025